【Materials Studio应用实例】三唑类杀菌剂戊康唑的晶型选择对提高其杀菌活性的重要性

摘要：

本研究利用高分辨率x射线粉末衍射和三维晶体结构建模技术，对六种技术苯唑类药物(BX、HH、JP、QZ、SJ和yt)的晶体结构进行了表征。分析了三羧酸(TCA)循环代谢的差异，并与甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)进行了分子对接。结果表明，戊康唑存在三种晶体形态:重叠对构象、并排对构象和平行对构象。具有平行对构象和最小晶胞体积的qz表现出较高的活性和较低的抗性水平。XHR的TCA循环代谢物和磷酸盐含量高于YJS，但暴露于qz显著降低了XHR中柠檬酸盐、异柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐和多草酰乙酸盐的含量，其他技术苯唑的含量也显著降低。此外，F487L、G464S和G443S点突变改变了手性立体R-QZ与CYP51蛋白的结合特性。特别是G443S突变促进了fr-qz与leu380和tyr126的弱连锁，并极大地抑制了低对接评分的结合作用。综上所述，我们的研究结果证明了戊康唑有效的晶体结构可以提高葡萄球菌的杀虫活性，并且证明了灰葡萄球菌对戊康唑抑制TCA循环代谢和CYP51蛋白突变的潜在适应性。

引言：

灰葡萄孢，根据杀菌剂抗性行动委员会(FRAC,2020)的说法，由于其活跃的多产繁殖和高遗传变异性，是一种“高风险”病原体。

本研究利用高分辨率x射线粉末衍射(XRPD)对不同来源的6个技术品种戊康唑的结构形态进行了表征，并利用Pawley精化模块进行了构象分析，建立了其三维晶体结构模型。采用浓度和时间相关的方法测定了它们对敏感和耐药葡萄球菌分离株菌丝生长的杀真菌作用。三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环代谢是连接绝大多数个体代谢途径的最重要的中心途径(Akram,2014)，我们通过B. cinerea代谢物检测监测其代谢过程，并对甾醇14α-去甲基化酶蛋白进行突变进行分子对接。目的是确定戊康唑的最佳构象，以提高其杀菌活性和合理应用。

计算方法：

将XRPD数据导入Materials Studio软件，利用Reflex模块对实验衍射谱进行背景减相和Kα2消噪处理，高斯宽度为0.1。然后在粉末处理模块中使用二分类程序对参数空间进行量纲搜索，通过反射粉末索引模块对所选峰的衍射分数模式进行索引，使用X-Cell程序计算综合峰廓，然后根据FOM质量因子选择最佳索引晶体参数(Yin et al.,2006)。通过Pawley精化对x-衍射谱的最终参数进行修改和调整，直到最小R- wp值为10%。

EBI杀菌剂靶酶甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)的晶体结构可在Protein Data Bank(PDB ID:5EAC)中获得(Tyndalletal.，2016)。5eac蛋白的点突变参考了已有的报道(Zhao et al.，2022;Lichtemberg等人，2017;maair等人,2020),并使用官方PyMOL构建(Schrödinger Inc)运行。利用蛋白制备模块提供的能量最小化，在OPLS3力场(RMSD<0.3Å)下对5EAC蛋白的突变结构进行优化。使用SiteMap模块(4Å)确定排名最高的潜在受体结合位点，并使用Receiver Grid Generation模块定位优化蛋白结构中得分最高的口袋。LigPrep模块生成配体摩尔分子的三维结构(立体异构体≤32/li-gand)后，与Glide模块(Maestrov11.1,Schrödinger Inc.)进行分子对接(Ramatenki et al.，2017；刘等人，2022)。

结果与讨论：

在图1中，吡唑菌酯以四种不同的互变异构晶体形式存在，但晶体形式IV具有最稳定的热力学(Ziegler et al.,2005)。偶氮嘧菌酯具有A型、B型和无定形三种形态，其无定形形态作为植物保护剂最具活性。

6个teb的多态性可通过其独特的XRPD模式进行区分，并可通过2-theta数据进行识别。所有TEBs在2θ(10.2、12.2、13.3、16.0、16.8、19.7、21.7、25.0、26.0和27.4)处均出现10个尖峰，且具有特征强度(图2和图1)。此外，还出现了11.9、14.0、15.5、17.3、17.9、18.5、19.4、20.2、20.5、23.0、23.5、24.1°的几个不同的峰值sat2θ(图2B)，表明每个TEB都有自己的特征XRPD剖面。

通过改进的Rietveld细化程序模拟退火，构建了6种teb的三维晶体结构。晶体结构在三维坐标中的原子位置列于表S2-S7。在teb的多态性中观察到三种类型的晶体结构(图3)。

采用葡萄球菌敏感分离株YJS评价TEBs对菌丝生长的抑制作用。每12小时处理得到的中位抑制浓度(EC50)如图4所示。

测定TEBs对灰灰双球菌YJS和XHR菌丝生长动力学的时间效应(图5)。对YJS进行试验时，在0.5μgmL−1浓度下，QZ和BX的抑制活性为85%，明显优于SJ。

在对照实验中，XHR的柠檬酸(397.190μg−1)、α-酮戊二酸(172.848μg−1)、富马酸(72.523μg−1)和苹果酸(535.150μg−1)含量均高于YJS，琥珀酸(191.771μg−1)和草酰乙酸(37.808μg−1)含量显著高于YJS，显示出较强的物质代谢能力。此外，XHR的磷酸含量(717.042μg−1)也显著高于YJS，说明XHR具有较强的氧化磷酸化能力。但草酸含量(38.850μg−1)远低于YJS，表明XHR致病性降低(图6A)。

获得了甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)蛋白中的F487L、G464S和G443S点突变，并绘制了CYP51蛋白晶体结构中手性立体R-/S-QZ的结合区(图7)。

总结：

综上所述，通过x射线衍射谱和Pawley精细化对戊康唑的三维晶体结构进行了构建和表征，证明戊康唑具有最小晶胞体积的平行对构象，具有较高的杀菌活性。耐药病原菌具有较强的代谢潜能cyp51突变功能，但目前对替布康唑中度耐药的发展存在毒力代价。综上所述，选择和控制戊康唑晶型的策略将提高杀菌剂使用的合理性和环境友好性。