【Discovery Studio应用实例】浙江工业/中国计量学院成果展示：一种快速筛选天然美白候选物芍药根及其分子对接机制研究

摘要：

民族药理学相关性：芍药根是中国几千年来传统使用的美白药物。虽然一些酪氨酸酶抑制剂和/或抗氧化剂，如1,2,3,4,6-五没食子酸，已经被分离和鉴定，但它们的酪氨酸酶抑制途径(单酚酶或二酚酶抑制，或两者都抑制)尚未被系统地研究，其潜在的酪氨酸酶抑制机制尚未揭示。此外，迫切需要探索新的天然酪氨酸酶抑制剂和抗氧化剂。

研究目的：建立一种基于微孔板的高分辨率酪氨酸酶抑制谱分析方法，并进一步建立三分辨率单酚酶/二酚酶/自由基清除工程谱分析方法，以加速鉴定复杂植物提取物中的生物活性化合物。

材料和方法：采用高效液相色谱-高分辨率质谱和制备高效液相色谱进行靶向分离和结构鉴定。它允许是一个概念的证明与白芍粗提取物的根作为一个天然的美白草药。

结果：芍药苷对单酚醇酶活性有特异性抑制作用。而1,2,3,4,6-五没食子酸葡萄糖、没食子酸和儿茶素对单酚酶和二酚酶均有抑制作用。其中1,2,3,4,6-五没食子糖基葡萄糖可抑制单酚醇酶活性为首次报道。此外，抗氧化性能归因于儿茶素，1,2,3,4,6-五没食子酸和没食子酸。由于芍药根中酪氨酸酶抑制剂和自由基清除剂的含量低、结构复杂，高分辨率质谱初步鉴定其为六烯基葡萄糖，有待进一步验证。此外，分子对接揭示了生物活性酶抑制剂主要通过氢键和范德壁与酪氨酸酶的氨基酸催化残基相互作用，这可能有助于了解其在皮肤美白中对酪氨酸酶的抑制机制。

结论：该平台为快速筛选天然美白活性成分提供了一种有效的方法。

引言：

皮肤美白是女性追求的永恒目标，尤其是在亚洲地区(Thanigaimalai et al.,2017)。防止黑色素的生物合成已被证明是皮肤美白的直接途径。

近年来，一种高分辨率谱分析方法因其快速、高效、明显的筛选酶抑制剂(Schmidt et al.,2012)而被报道，该方法根据化合物的特定抑制活性筛选生物抑制剂，从而最大限度地降低了筛选假阳性配体的风险。此外，该方法可以在短时间内直接从复杂的粗提取物中确定生物活性成分，而无需进行预纯化。所报道的高分辨率谱分析方法已成功应用于筛选抗糖尿病相关酶抑制剂，如α -葡萄糖苷酶抑制剂、α-淀粉酶抑制剂、PTP1B抑制剂(Li et al.,20119a；Zhao et al.,2018)。到目前为止，还没有筛选酪氨酸酶抑制剂等与美白相关的酶抑制剂的报道。

在本研究中，我们首次报道了一种新的基于微孔板的高分辨率酪氨酸酶抑制/自由基清除试验，结合高效液相色谱和四极杆飞行时间质谱(HPLC-ESI-qTOF-MS/MS)和制备型高效液相色谱(HPLC)，从芍药根中鉴定酪氨酸酶抑制剂和/或抗氧化剂，以证明这一概念。结合分子对接分析，初步揭示生物活性成分潜在的抑制机制。

分子对接试验：

在本研究中，2Y9W被定义为受体；然后去除先前存在的配体。根据晶体结构确定了其活性部位空腔。对接计算采用Discovery Studio 4.0 (Accelrys Co.,Ltd, US)的CDOCKER模块进行分子对接，小分子的再加工采用制备配体界面，受体的再加工采用制备蛋白质界面，所有参数均采用默认设置。

结果与讨论：

本研究结合HPLC-ESI-qTOF-MS/MS、prep-HPLC和分子对接，建立了基于微孔板的酪氨酸酶(包括单酚酶和二酚酶)抑制实验，作为三分辨率单酚酶/二酚酶抑制/自由基清除分析平台的一部分。如图1所示，该策略可以根据化合物的特定抑制活性筛选生物抑制剂，从而将筛选假阳性配体的风险降至最低。

为保证所有组分在酪氨酸酶测定系统中完全溶解，应研究合适的溶剂。DMSO被认为是通用溶剂，因为它具有接受氢键的能力和相对小而致密的结构(Chen et al.,2003)。因此，将DMSO添加到微孔板孔中，以确保干燥后馏分完全溶解。而高浓度的二甲基亚砜可能导致酪氨酸酶可逆失活(Chen et al.,2003)。为了评估DMSO的合适浓度，研究了六种不同DMSO百分比的溶液。如图2所示，当DMSO浓度从0%增加到2%时，二酚酶的相对活性仅从100%略微下降到96.96%。

用上述酪氨酸酶抑制法和前文所述的自由基清除法测定白芍根富集提取物微分离后96孔微孔板的含量。结合HPLC图精确指出单酚醇酶抑制剂、二酚酶抑制剂和自由基清除剂的HPLC峰，得到单酚醇酶/二酚酶/ABTS自由基清除三重高分辨率生物色谱图如图3所示。如图3所示，在单酚醇酶抑制活性方面，峰6、峰8和峰11在生物测定中反应较强，HPLC吸光度较弱，而峰1、峰3、峰7、峰9和峰10反应较弱或不确定。

对接模拟进一步探索了白芍根中4种有效抑制剂(如图4所示)对酪氨酸酶的作用机制，包括没食子酸、儿茶素、没食子基芍药苷和1,2,3,4,6-五没食子基葡萄糖。筛选的抑制剂与酪氨酸酶相互作用的对接结果如图5和图6所示。从表3可以看出，对于单酚酶，没食子酸中有5个氢键，其中有HIS56、ASN57、TYR58、GLU335、HO404、THR334、ASP336和LYS63 8个残基,其相互作用能为−31.2125kcal/mol。芍药苷的对接能为−32.1541kcal/mol，与TYR58、LYS63、ASN57和HIS56 4个活性残基有8个氢键相互作用。

总 结：

这种高效的生物活性分析平台首次被报道在短时间内直接从复杂的粗提物中确定生物活性成分，并有效地揭示其酪氨酸酶的初步抑制机制。

与传统的亲和引导筛选酪氨酸酶抑制剂的方法不同，该方法简单，耗时少，灵敏度高，效率高，没有筛选假阳性配体的固有风险。更重要的是，通过分子对接分析，系统地阐明了潜在抑制剂对酪氨酸酶的抑制机制。综上所述，酪氨酸酶/自由基清除高分辨率谱分析与HPLC-ESI-qTOF-MS/MS相结合是一种从复杂天然资源粗提物中识别潜在安全美白物质的可行方法。